可定量觀察活細胞的膜相態！

可定量觀察活細胞的膜相態！

LipiORDER ＜Membrane Lipid Order Imaging Dye＞

LipiORDER是環境響應型的熒光色素，可通過成像生物膜的相態 (Lipid order）Lo/Ld實現定量觀察。即使在活細胞中也顯示高度化學穩定性，且可觀察到各種膜結構的相態，如細胞膜、細胞內膜等。

※ 本產品由funakoshi 株式會社基于高知大學教育研究部綜合科復合領域科學部門 仁子陽輔博士的研究成果商品化并銷售。

※ 本產品僅供研究，研究以外不可使用。

LipiORDER成像和神經細胞染色示例

依賴生物膜相態的本試劑的熒光特性變化（左）和神經細胞神經突起部位的染色案例（右）

◆生物膜相態(Lipid order)是什么？

構成生物膜的脂質種類繁多，膜的狀態因其脂質組成而大不同。例如，僅由飽和脂肪酸構成的脂質膜因密度高且包裹堅固的特點，被稱為有序相（Lo）；由含有不飽和脂肪酸脂質構成的脂質膜因密度低，被稱為無序相（Ld）。像這樣的脂質微環境被稱為相態（Lipid order)。在簡單模型中，Lo和Ld分離并發生明確的相分離（如圖），但由于細胞生物膜中的脂質種類繁多，不會發生圖中模型所示的簡單相分離，而是反映總和性質的相態。

另外，膜蛋白的存在也被認為會影響相態，而實際細胞膜上的相態更為復雜。細胞膜上的Lo有時也被稱為脂筏（Lipid raft），作為生物膜的功能域備受關注。這種脂質膜相態的觀察對于理解膜的生物物理學性質（如生物膜的流動性和硬度等）非常重要，期待未來能開發出針對它的分析方法。

脂質膜的相態成像

近年，Laurdan、di-4-ANEPPDHQ、Nile Red等響應分子極性并發生色調變化的熒光色素（solvatochomic dye) 已被應用于生物膜的相態可視化。由于這些分子極性響應型熒光色素會根據相態改變熒光波長，通過檢測特定激發光中的兩種波長的熒光獲得其熒光強度比，可半定量分析相態。（詳細信息，請參閱下述的“原理"）。

然而，這些試劑在實際使用中還存在如細胞內局部不均勻、對光不穩定等問題，。本產品LipiORDER利用高知大學的仁子陽輔博士和Strasbourg大學的Andrey Kylmchenko博士的團隊開發的新型芘衍生物熒光探針（原著論文名PK），以及在Lo、Ld上熒光特性不同的特征，可定量分析生物膜相態。與Laurdan相比，顯示很高的光穩定性，在活細胞中也能維持化學穩定性，因此活細胞成像優異。

參考：膜的相態成像應用實例

相態被認為是決定脂質膜流動性的參數，以Laurdan為首，相態成像被用于各種生命現象的分析。Laurdan會根據相態將熒光波長由藍色（Lo）變為綠色（Ld），觀察藍色和綠色兩種波長的熒光，其熒光強度比（綠色熒光強度/藍色熒光強度）和GP值（generalized polarization；(F_blue-F_green/F_blue F_green）的計算值可用于評價相態。例如進行外部刺激（藥物處理、氧化應激等）、基因操作（目的基因的過表達或敲降）引起的細胞形態結構變化及其相態的分析。此外，作為細胞功能分析的一環，還觀察到了細胞類型間的相態比較。

Laurdan：在觀察到兩種波長的熒光后，從觀察圖像中計算出熒光比（或GP值），使用擬色進行比率型圖像分析。

◆原理

LipiORDER是根據溶劑的分子極性改變熒光特性的溶劑極性響應型熒光色素（Solvatochromic fluorescent dye)（圖1）。此外，本試劑對脂質膜具有高親和性，濃縮在細胞的膜結構中。通過這兩個特點，本試劑根據膜內部的極性將熒光由綠色變為紅色。相態反映了脂質的包裹密度，稀疏包裹的Ld極性高，而緊密包裹的Lo極性低，通過觀察膜結構的極性可定量觀察相態（圖2上）。實際上，與模型Lo相（sphingomyelin/Cholesterol; SM/Chol）顯示綠色熒光（熒光波長最大~510 nm）相對，模型Ld相（dioleylphosphatidylcholine；DOPC）發生長波長偏移，顯示紅色熒光（熒光波長最大~575 nm）（圖2下）。另外，在被認為是SM/Chol與DOPC中間模型的DOPC/Chol中，觀察到SM/Chol與DOPC中間的熒光光譜，可通過觀察本試劑獲得的綠色熒光強度F_G（熒光顯微鏡中的檢測波長范圍約為500~550 nm）和紅色熒光強度F_R（檢測波長范圍約550~650 nm）的熒光強度比F_R/F_G，相對定量膜相態。

圖1. 溶劑的分子極性依賴性熒光響應性

圖2. 溶劑的分子極性依賴性熒光響應性

上圖：根據相態的熒光特征變化圖  下圖：模型脂質體中的熒光光譜

◆特點

●　由405 nm激發產生的綠色熒光強度F_G（500~550nm）和紅色熒光強度F_R（550~650nm）的熒光強度比F_R/F_G和相態之間存在相關性。

●　※ 本試劑幾乎不被488 nm激光吸收，可作為激發488 nm以上的光的熒光色素使用。

●　顯示出的性質：熒光比F_R/F_G的值越大，則越接近無序相Ld狀態；F_R/F_G值越小，則越接近有序相Lo狀態。

●　極性響應型熒光色素，在低極性環境中發出熒光。在水溶液中不發出熒光，在高S/N比下可觀察到膜結構和脂肪滴。

●　只需將本試劑添加至活細胞中，即可攝入至細胞膜、內膜和脂肪滴，并會根據膜的相態表現出不同的熒光特性。

●　擁有脂質體模型、培養細胞和斑馬魚的染色實績。

●　※ 有關斑馬魚的染色情況，請參考原著論文。

●　已確認本試劑的熒光特性幾乎不受蛋白、多糖等的影響。

●　與現有的分子極性響應型熒光色素Laurdan相比，顯示更高的光穩定性。

◆原著論文

Valanciunaite et al., Anal. Chem., 92, 6512-6520 (2020)　Polarity Mapping of Cells and Embryos by Improved Fluorescent Solvatochromic Pyrene Probe.

◆觀察注意事項

生物膜相態是通過熒光比來定量的，所以需要檢測在405 nm激發下的兩種波長的熒光。同時在Green頻道約500-550 nm和Red頻道約550-650 nm獲得熒光，再使用各種分析軟件算出熒光比。為獲取熒光比，在每次熒光觀察時需注意不能使信號飽和。這種色素在488 nm、560 nm處不吸收，所以可與一般的綠色、紅色和近紅外熒光發生共染色。建議獲取以下溶液的熒光圖像作為校準對照：

◆應用數據

■　活細胞成像

添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至COS7細胞中，培養10 min后用激光共聚焦顯微鏡獲取兩種波長的熒光圖像（激發光：405 nm；熒光Green：470-550 nm，Red：550 nm~）。通過ImageJ對綠色熒光圖像和紅色熒光圖像進行比率測量分析（熒光比F_R/F_G），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可視化相態。細胞膜的F_R/F_G低，估計在ER等細胞內膜中F_R/F_G高。

Heat map的詳細分析結果。

將比率測量分析圖像的各個熱圖層抽出，并分析。

■　觀察神經細胞膜的相結構

添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至E17.5小鼠來源的海馬原代神經細胞（DIV3或DIV12）中，培養10 min后用激光共聚焦顯微鏡獲取兩種波長的熒光成像（激發光：405 nm、熒光Green：470~550 nm，Red：550 nm~）。通過ImageJ對綠色熒光圖像和紅色熒光圖像進行分析（熒光比F_R/F_G），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可視化相態。通過比率測量分析，可觀察到在所有膜結構中，細胞膜的F_R/F_G低，與Lo的環境接近；內膜結構的F_R/F_G高，與Ld的環境接近。

各個圖像的熒光觀察圖像以及比例分析的應用。

在激光共聚焦顯微鏡的405 nm激發光下，使用綠色熒光圖像（470-550 nm）和紅色熒光圖像（550 nm以上），并通過ImageJ算出比率測量分析圖像。

將比率測量分析圖像的疑似色熱圖階段性分割，可以看出，F_R/F_G（接近Lo）的信號，隨著熒光比率不斷增大（接近Ld），會距離細胞膜越來越遠。

■　觀察依賴于細胞外刺激的膜相態變化

用膽guchun去除劑的β-cyclodextrin（β-CD; 15 mM）處理COS7細胞4 h，清洗細胞，并添加LipiORDER（300 nM in HBSS），培養細胞10 min后用激光共聚焦顯微鏡獲取兩種波長的熒光圖像（激發光：405nm，熒光Green：470-550nm，Red：550nm~）。通過ImageJ對綠色熒光圖像和紅色熒光圖像進行比率測量分析（熒光比F_R/F_G），并用擬色（Lo■■■■■■■Ld）可視化相態。通過β-CD處理可觀察到細胞結構的顯著變化，提取熱圖的深綠色層（熒光比0.06-0.34）時，發現其分布發生了很大的變化。

※ 上述細胞染色數據，由名古屋市立大學大學院 藥學研究科 服部光治教授提供。

■　光穩定性

比較現有的分子極性檢測試劑Laurdan和LipiORDER的光穩定性。與Laurdan表現出顯著的光衰減相比，LipiORDER即使在暴露1 h后仍保持穩定。該試劑也可用于長期成像。

※ 本頁面產品僅供研究用，研究以外不可使用。