用于脂肪酸代謝過程的多色活細胞成像試劑

LipiDye^®-M ＜Lipid Metabolism Tracer＞

用于脂肪酸代謝過程的多色活細胞成像試劑

LipiDye^®-M是一種由環境響應熒光染料標記的熒光標記脂肪酸。LipiDye^®-M的熒光顏色會根據脂質的代謝狀態及其周圍環境的不同發生明顯的變化，因此可以通過綠色、黃色和紅色熒光反應觀察到脂肪酸的代謝過程。本產品可用于脂質代謝相關的基礎研究和以脂質代謝為靶點的藥物開發研究。

※本產品是以名古屋大學transformative生物分子研究所 山口茂弘教授和多喜正泰特任副教授 的研究成果為基礎，由Funakoshi株式會社進行商品化并銷售。

※本產品僅供研究，研究以外不可使用。

LipiDye^®-M細胞內脂質代謝過程圖（左）和染色示例（右）

LipiDye^®-M是一種環境響應性染料標記脂肪酸，它的特性是通過脂肪酸轉運蛋白進入細胞后，在細胞內參與脂質代謝過程時，熒光會隨著每次局部反應變化而發生變化。通過成像獲取綠色熒光和紅色熒光圖像并將兩者疊加，可以觀察到與脂質代謝狀態相關的三種不同顏色的結果。

◆脂肪酸代謝與LipiDye^®-M

脂肪酸是脂質的最小單位，在細胞內可轉化為各種脂質結構，如酰基fumeiA、磷脂、糖脂、甘油二酯(DAG)和甘油三酯(TAG)等。脂肪酸代謝受到多種酶的嚴格調控，因此酶和調控機制的改變也被認為與脂質代謝類疾病有關。為充分探究脂質的代謝過程，熒光標記脂肪酸作為分析脂肪酸代謝過程的工具被廣泛使用，但由于其顏色不隨脂肪酸代謝的過程而改變，因此難以區分各個代謝階段并逐一進行分析。

LipiDye^®-M（論文原名：AP-C12）是一種能夠克服上述問題的新型熒光標記脂肪酸。由名古屋大學transformative生物分子研究所 山口茂弘教授和多喜正泰特任副教授研究開發，使用C12脂肪酸為載體，連接新型熒光色素Azapyrene，含熒光基團在內總長相當于C18脂肪酸（圖1左）。Azapyrene不同于常規使用的熒光染料，能夠識別周圍分子的極性使吸收波長與熒光波長同時發生變化。Azapyrene具有在強極性環境（親水性）中轉變為綠色，在弱極性環境（疏水性）中轉變為紅色的特性。因此通過選擇適宜的激發光源和檢測波段，可以區分和觀察各種環境中的脂質代謝狀態。

根據上述性質，LipiDye^®-M通過脂肪酸轉運蛋白攝入細胞后，在細胞內參與脂質代謝過程，轉化為各種脂質結構。在其轉移到細胞內的不同位置后，即如圖2所示，熒光顏色會根據細胞器膜極性發生變化。通過熒光顯微鏡觀察使用LipiDye^®-M處理后的活細胞，得到綠色熒光圖（激發：450-490 nm，推薦：473 nm；發射：490-540 nm）和紅色熒光圖（激發：540-600 nm，推薦：559 nm；發射：570-620 nm），將兩者重疊后即可獲得如圖3所示的三色可視化脂質代謝狀態圖。在重疊后的圖像中，細胞質（游離脂肪酸，酰化CoA）及線粒體腔（β脂肪酸氧化代謝產物）顯示為綠色，各種細胞器膜（磷脂，DAG等）顯示為黃色，脂滴（TAG）顯示為紅色。對綠色熒光圖與紅色熒光圖進行各種比率分析，可進行進一步的定量解析。若想了解根據比率解析進行定量解析的方法，請參考原著論文^[1]。

圖2：LipiDye^®-M代謝過程與熒光變化過程圖

◆特點

● 根據脂肪酸代謝和細胞器環境的不同，熒光顏色呈綠色~紅色變化。

● 可根據熒光圖追蹤脂肪酸代謝過程。

● 作為游離脂肪酸的LipiDye^®-M通過脂肪酸轉運蛋白進入細胞后，在細胞內可轉化為酰基fumei A、甘油二酯（DAG）、甘油三酯（TAG）、磷脂及

   β脂肪酸氧化產物。

● 熒光在強極性環境（細胞質）下呈綠色、中極性環境（細胞膜）下呈黃色、弱極性環境（脂滴）下呈紅色。

● 綠色熒光圖（激發：450-490 nm，推薦：473 nm；發射：490-540 nm）和紅色熒光圖（激發：540-600 nm，推薦：559 nm；發射：570-

   620 nm），將兩者重疊后可獲得三色可視化脂質代謝狀態圖。通過所得的綠色/紅色熒光比率，可進行定量比率分析。

熒光波長（激發/發射波長）

為了準確觀察LipiDye^®-M的環境響應性差異，需要確定最佳激發波長和熒光波長。推薦使用共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察，實驗時可參考下表范圍。

LipiDye^®-M在PBS、磷脂脂質體和大豆油中的激發光譜和發射光譜

◆應用實例

脂肪細胞染色例

向脂肪細胞（由3T3-L1細胞分化）中添加LipiDye^®-M（5μM），添加后無需清洗，分別在1分鐘后和30分鐘后，使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察熒光（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）。添加1分鐘后，從細胞質中觀察到較強的綠色熒光信號。同時觀察到脂滴的紅色熒光信號較弱，因此可推測LipiDye^®-M主要以游離脂肪酸或脂肪酸CoA狀態存在于細胞中，尚未被脂滴充分攝入。添加30分鐘后，綠色熒光信號減弱，脂滴的紅色熒光信號增強，LipiDye^®-M轉變為TAG，由此可推測脂滴已充分攝入LipiDye^®-M。使用TAG合成酶（DGAT）抑制劑進行處理，30分鐘后，能觀察到脂滴的紅色熒光信號明顯被抑制，內質網（ER）等細胞器膜呈現的黃色熒光信號增強。這一結果表明，LipiDye^®-M在轉化為DAG后并未繼續轉化為TAG，而是滯留于內質網等細胞器膜上。

HepG2細胞染色例

在含有油酸和棕櫚酸的10% FBS條件下培養HepG2細胞，以促進脂滴產生。使用HBSS替換培養基，在饑餓狀態下使用LipiDye^®-M（5μM）處理60分鐘后，于未洗滌條件下使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）。細胞饑餓狀態下可觀察到LipiDye^®-M分布于HepG2細胞的細胞質（綠色），內質網（黃色），脂滴（紅色）及線粒體（黃色）中。為確認LipiDye^®-M的代謝狀態，抽取HepG2細胞中的脂質成分并使用TLC分離后，以LipiDye^®-M的熒光為指標進行檢測。觀察到TLC板上的多點表明，LipiDye^®-M在HepG2細胞中被轉化為各種脂質，TAG或膽guchun酯分布在游離脂肪酸型LipiDye^®-M的上方（高疏水性），細胞器中的β脂肪酸氧化（FAO）代謝產物和DAG分布在下方（低疏水性），磷脂則被認為分布在原點附近。

為確認LipiDye^®-M的代謝狀態，抽取HepG2細胞中的脂質成分并使用TLC分離后，以LipiDye^®-M的熒光為指標進行檢測。觀察到TLC板上的多點表明，LipiDye^®-M在HepG2細胞中被轉化為各種脂質，TAG或膽guchun酯分布在游離脂肪酸型LipiDye^®-M的上方（高疏水性），細胞器中的β脂肪酸氧化（FAO）代謝產物和DAG分布在下方（低疏水性），磷脂則被認為分布在原點附近。

藥物處理引起的脂質代謝變化

在含有CoA合成酶（ACS）抑制劑（Triacsin C）或TAG合成酶DGAT1抑制劑 （T863）的培養基中，對HepG2 細胞進行18小時的預處理，以抑制細胞內代謝途徑（右圖）。之后，為了促進脂滴的產生，在饑餓條件下用含有油酸 (0.5 mM)、抑制劑和 LipiDye^®-M（5 μM）的HBSS培養基處理細胞6小時。在未洗滌的條件下使用共聚焦激光掃描顯微鏡（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559nm / Em 570～620 nm）進行觀察。與對照組中脂滴的強紅色熒光相比，經ACS抑制劑處理后的細胞中脂滴的紅色熒光和細胞器膜的黃色熒光變弱，觀察到綠色熒光較強。而另一組經DGAT1抑制劑處理后的細胞中，脂滴的紅色熒光幾乎無法用肉眼識別，細胞器膜的黃色熒光顯著增強。經過ACS抑制劑處理過后的細胞由于無法將含LipiDye^®-M的游離脂肪酸轉化成酰基CoA，因此仍然以游離脂肪酸的形態存在于細胞中。另外也確認到了DAG由于DGAT1抑制劑的影響無法轉化成TAG，使其無法轉移至脂滴并積聚在內質網及其他細胞器膜上。如上述實例所示，在使用藥物對細胞進行處理時，可通過對LipiDye^®-M進行局部熒光分析，了解藥物參與脂質代謝的哪一過程。

脂質分解途徑抑制劑的作用

在含有自噬抑制劑（50 nM Bafilomycin A1；自噬體-溶酶體膜融合抑制劑）或脂肪分解抑制劑（100 μM DEUP）的HBSS培養基和LipiDye^®-M（5 μM）的HBSS中培養HepG2細胞6小時后，使用共聚焦激光掃描顯微鏡（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559nm / Em 570～620 nm）進行觀察，得到重疊后的熒光圖像和比率分析圖。在重疊后的對照組熒光圖像中，囊泡樣結構（自噬體）的膜呈黃色，因此可推斷由自噬引起的脂質分解受到了抑制。另外，在使用脂肪分解抑制劑培養HepG2細胞的組中，觀察到重疊熒光圖像中整體的紅色熒光增強，由此可見LipiDye^®-M多積累于脂滴中和細胞器膜上。

通過比率分析圖和分布圖可得知，相比于對照組和自噬抑制劑處理后的細胞，使用脂肪分解抑制劑處理的細胞其熒光Green/Red的比率大幅減少。

※具體的比率解析方法請參考原著論文。